在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，科學(xué)家們一直在探索如何更有效地修復(fù)人體組織。通過3D打印技術(shù)實(shí)現(xiàn)人體組織的模擬和再生，被視為一種極具潛力的解決方案。3D打印技術(shù)以其高精度、可定制化和材料多樣性等特點(diǎn)，為生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域帶來了革命性的變化。

最近，來自浙江大學(xué)謝志堅(jiān)、賀永團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)開發(fā)了一種仿生皮膚，包括利用近場直寫技術(shù)（MEW）制備的PCL膜片，GelMA和HAMA調(diào)配的GH凝膠和負(fù)載富血小板血漿（PRP）的HAMA凝膠。通過結(jié)構(gòu)仿生和生理仿生，利用時(shí)空調(diào)控促進(jìn)了大面積傷口的早期愈合。通過構(gòu)建了大鼠皮膚缺損傷口模型評估了該仿生皮膚的體內(nèi)治療效果。

相關(guān)研究成果以“A Spatiotemporal Controllable Biomimetic Skin for Accelerating Wound Repair”為題于2024年2月22日發(fā)表在《Small》上，論文鏈接：https://doi.org/10.1002/smll.202310556。

        

        圖1 仿生皮膚的的組成和功能示意圖

1.向心性PCL膜作為表皮提供力量并促進(jìn)細(xì)胞分化

考慮到從外圍到中心的自然傷口愈合過程，設(shè)計(jì)了一種具有向心力學(xué)指數(shù)的膜來引導(dǎo)細(xì)胞遷移。MEW技術(shù)用于打印這種模擬皮膚角質(zhì)層的多尺度拓?fù)淠?。該膜由用于?xì)胞附著的無序致密纖維（≈10μm）、提供向心力學(xué)指數(shù)的向心輻條纖維 （50μm） 和用于封裝和縫合力的圓周框架纖維 （500μm） 組成。

PCL膜片制備過程及最終產(chǎn)物如圖2A.B所示。通過拉伸應(yīng)力應(yīng)變實(shí)驗(yàn)證具有圓周框架的PCL膜片表現(xiàn)出良好機(jī)械性能（圖2.C）。利用人永生化角質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了內(nèi)部存在向心性輻條的PCL膜片能夠促進(jìn)細(xì)胞黏附、引導(dǎo)細(xì)胞遷移和促進(jìn)細(xì)胞分化（圖2.D-H）。

        

        圖2  PCL膜片的物理表征和生物學(xué)功能探索

2.GH水凝膠作為真皮層攜帶和釋放細(xì)胞

在通常持續(xù) 3-5 天的炎癥反應(yīng)期間，生物材料需要保護(hù)它們攜帶的細(xì)胞。當(dāng)外周環(huán)境變溫和時(shí)，即在炎癥期結(jié)束時(shí)，生物材料應(yīng)及時(shí)降解以釋放細(xì)胞，防止阻礙其生長和功能。GelMA作為GH水凝膠的主要成分，其質(zhì)地柔軟且易降解。少量HAMA與GelMA混合可減緩GH水凝膠的降解，增強(qiáng)其機(jī)械強(qiáng)度（圖3.A）。   

調(diào)配多種濃度的GH凝膠進(jìn)行物理表征（圖3.B-D）。隨著HAMA濃度的增加，GH凝膠的機(jī)械強(qiáng)度增加，溶脹曲線無明顯差異，但是降解時(shí)間呈明顯不同。5% GelMA+0.25% HAMA凝膠在第四天時(shí)開始快速降解，并于第七天時(shí)降解完畢，與傷口修復(fù)時(shí)炎癥期的時(shí)間點(diǎn)基本符合，因此作為GH凝膠終選濃度。并且通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)其良好的生物相容性（圖3.E, F）。

        

        圖3 GH凝膠的物理表征和生物學(xué)功能探索

3.HP水凝膠作為皮下組織層滋養(yǎng)細(xì)胞并促進(jìn)其遷移  

在材料植入后的初始階段，雖然水凝膠可以減少炎癥物質(zhì)對細(xì)胞的影響，但它也阻礙了營養(yǎng)吸收，減緩了細(xì)胞增殖。因此，使用HP凝膠持續(xù)滋養(yǎng)細(xì)胞（圖4A）。HAMA是透明質(zhì)酸的一種改良形式，在傷口中緩慢降解。當(dāng)與PRP結(jié)合時(shí)，釋放出有益的生物活性因子。HP凝膠不僅在早期作為細(xì)胞增殖的營養(yǎng)來源，而且在后期作為細(xì)胞遷移的興奮劑。   

調(diào)配多種濃度的HP凝膠進(jìn)行物理表征（圖4.B-D）。隨著HAMA濃度的增加，HP凝膠的機(jī)械強(qiáng)度增加，溶脹減小，降解變慢。表皮生長因子（EGF）作為釋放指標(biāo)進(jìn)行緩釋實(shí)驗(yàn)，證實(shí)5%HAMA + 20%PRP 釋放因子速率穩(wěn)定且合適，故以此濃度作為后續(xù)HP凝膠的濃度。通過用凝膠共培養(yǎng)細(xì)胞來評估HP凝膠對細(xì)胞增殖和遷移的影響，并最終證實(shí)HP凝膠促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和遷移（圖4.E-J）。

        

        圖4 HP凝膠的物理表征和生物學(xué)功能探索

4.仿生皮膚具有內(nèi)部協(xié)同效應(yīng)

仿生皮膚采用逐層鑄造構(gòu)建，其中GH凝膠層嵌入PCL膜片，通過物理嵌合的方式穩(wěn)定結(jié)合。接下來，GH和HP凝膠在405 nm光的激發(fā)下，在兩者的表面產(chǎn)生C═C雙鍵使之緊密結(jié)合。該仿生皮膚使細(xì)胞能夠同時(shí)接受PCL膜和PRP的刺激：PCL膜促進(jìn)細(xì)胞粘附和分化，而HP水凝膠促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移（圖5.A）。   

建立了四組進(jìn)行比較：僅具有 GH 水凝膠的空白組 （Blank）、包含 GH 水凝膠和 HP 水凝膠的對照組 （GHP）、由 PCL 膜和 GH 水凝膠組成的另一個(gè)對照組 （PCL） 以及具有完整皮膚結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)組 （MS）。仿生皮膚同樣具有良好的機(jī)械強(qiáng)度（圖5.B）。生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中仿生皮膚保留了向心性PCL膜片和HP凝膠的功能，且二者同時(shí)存在時(shí)，相關(guān)基因、蛋白呈現(xiàn)顯著性高表達(dá)（圖5.C-G）。結(jié)果證實(shí)了，PCL膜和HP凝膠在仿生皮膚內(nèi)具有協(xié)同作用，二者相互放大了彼此的生物學(xué)效應(yīng)，同時(shí)保留了各自的功能。這種協(xié)同作用確保了仿生皮膚作為一個(gè)整體發(fā)揮更全面的作用。

        

        圖5 仿生皮膚的物理表征和生物學(xué)功能探索

        

        圖6 仿生皮膚促進(jìn)傷口愈合的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評估

5.仿生皮膚促進(jìn)傷口修復(fù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

使用大鼠的全層皮膚缺陷模型在體內(nèi)評估仿生皮膚的功效（圖6.A, B）。通過將PCL膜的外框縫合到傷口邊緣周圍的正常皮膚上，將完整的仿生皮膚與身體結(jié)合在一起。缺損區(qū)與仿生皮膚的直徑差異使PCL膜在早期持續(xù)拉伸周圍皮膚，并通過縫合的預(yù)張力加速傷口閉合。同時(shí)，水凝膠不斷釋放生物刺激以促進(jìn)組織再生。因此，仿生皮膚通過結(jié)合機(jī)械和生物機(jī)制促進(jìn)傷口閉合和修復(fù)。   

利用H&E和Masson染色進(jìn)行組織學(xué)評估（圖 6.C-F）。MS組顯著促進(jìn)肉芽組織再生，加速了膠原蛋白沉積，促進(jìn)了傷口的修復(fù)。免疫熒光染色也證實(shí)了MS組具有最快的血管化和再上皮化進(jìn)程（圖7）。

        

        圖7 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的免疫熒光染色結(jié)果

綜上，這項(xiàng)研究設(shè)計(jì)開發(fā)了一種PCL/GelMA/HAMA/PRP仿生皮膚。通過模擬皮膚結(jié)構(gòu)和傷口修復(fù)的生理過程，仿生皮膚有效地促進(jìn)了傷口的早期閉合和快速愈合。在傷口修復(fù)的初始階段，仿生皮膚的膜框架通過預(yù)張力幫助傷口閉合，同時(shí)細(xì)胞在水凝膠內(nèi)增殖。隨著時(shí)間的推移，框架逐漸降解，細(xì)胞從水凝膠中釋放并沿著殘留的膜遷移。整個(gè)過程中，皮下層水凝膠持續(xù)釋放細(xì)胞因子，確保傷口得到全面的營養(yǎng)供給。這項(xiàng)研究不僅為皮膚損傷的治療提供了新的解決方案，也為組織再生工程開辟了新的可能性。

文章來源： EFL生物3D打印與生物制造

在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，科學(xué)家們一直在探索如何更有效地修復(fù)人體組織。通過3D打印技術(shù)實(shí)現(xiàn)人體組織的模擬和再生，被視為一種極具潛力的解決方案。3D打印技術(shù)以其高精度、可定制化和材料多樣性等特點(diǎn)，為生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域帶來了革命性的變化。

最近，來自浙江大學(xué)謝志堅(jiān)、賀永團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)開發(fā)了一種仿生皮膚，包括利用近場直寫技術(shù)（MEW）制備的PCL膜片，GelMA和HAMA調(diào)配的GH凝膠和負(fù)載富血小板血漿（PRP）的HAMA凝膠。通過結(jié)構(gòu)仿生和生理仿生，利用時(shí)空調(diào)控促進(jìn)了大面積傷口的早期愈合。通過構(gòu)建了大鼠皮膚缺損傷口模型評估了該仿生皮膚的體內(nèi)治療效果。

相關(guān)研究成果以“A Spatiotemporal Controllable Biomimetic Skin for Accelerating Wound Repair”為題于2024年2月22日發(fā)表在《Small》上，論文鏈接：https://doi.org/10.1002/smll.202310556。

        

        圖1 仿生皮膚的的組成和功能示意圖

1.向心性PCL膜作為表皮提供力量并促進(jìn)細(xì)胞分化

考慮到從外圍到中心的自然傷口愈合過程，設(shè)計(jì)了一種具有向心力學(xué)指數(shù)的膜來引導(dǎo)細(xì)胞遷移。MEW技術(shù)用于打印這種模擬皮膚角質(zhì)層的多尺度拓?fù)淠?。該膜由用于?xì)胞附著的無序致密纖維（≈10μm）、提供向心力學(xué)指數(shù)的向心輻條纖維 （50μm） 和用于封裝和縫合力的圓周框架纖維 （500μm） 組成。

PCL膜片制備過程及最終產(chǎn)物如圖2A.B所示。通過拉伸應(yīng)力應(yīng)變實(shí)驗(yàn)證具有圓周框架的PCL膜片表現(xiàn)出良好機(jī)械性能（圖2.C）。利用人永生化角質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了內(nèi)部存在向心性輻條的PCL膜片能夠促進(jìn)細(xì)胞黏附、引導(dǎo)細(xì)胞遷移和促進(jìn)細(xì)胞分化（圖2.D-H）。

        

        圖2  PCL膜片的物理表征和生物學(xué)功能探索

2.GH水凝膠作為真皮層攜帶和釋放細(xì)胞

在通常持續(xù) 3-5 天的炎癥反應(yīng)期間，生物材料需要保護(hù)它們攜帶的細(xì)胞。當(dāng)外周環(huán)境變溫和時(shí)，即在炎癥期結(jié)束時(shí)，生物材料應(yīng)及時(shí)降解以釋放細(xì)胞，防止阻礙其生長和功能。GelMA作為GH水凝膠的主要成分，其質(zhì)地柔軟且易降解。少量HAMA與GelMA混合可減緩GH水凝膠的降解，增強(qiáng)其機(jī)械強(qiáng)度（圖3.A）。   

調(diào)配多種濃度的GH凝膠進(jìn)行物理表征（圖3.B-D）。隨著HAMA濃度的增加，GH凝膠的機(jī)械強(qiáng)度增加，溶脹曲線無明顯差異，但是降解時(shí)間呈明顯不同。5% GelMA+0.25% HAMA凝膠在第四天時(shí)開始快速降解，并于第七天時(shí)降解完畢，與傷口修復(fù)時(shí)炎癥期的時(shí)間點(diǎn)基本符合，因此作為GH凝膠終選濃度。并且通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)其良好的生物相容性（圖3.E, F）。

        

        圖3 GH凝膠的物理表征和生物學(xué)功能探索

3.HP水凝膠作為皮下組織層滋養(yǎng)細(xì)胞并促進(jìn)其遷移  

在材料植入后的初始階段，雖然水凝膠可以減少炎癥物質(zhì)對細(xì)胞的影響，但它也阻礙了營養(yǎng)吸收，減緩了細(xì)胞增殖。因此，使用HP凝膠持續(xù)滋養(yǎng)細(xì)胞（圖4A）。HAMA是透明質(zhì)酸的一種改良形式，在傷口中緩慢降解。當(dāng)與PRP結(jié)合時(shí)，釋放出有益的生物活性因子。HP凝膠不僅在早期作為細(xì)胞增殖的營養(yǎng)來源，而且在后期作為細(xì)胞遷移的興奮劑。   

調(diào)配多種濃度的HP凝膠進(jìn)行物理表征（圖4.B-D）。隨著HAMA濃度的增加，HP凝膠的機(jī)械強(qiáng)度增加，溶脹減小，降解變慢。表皮生長因子（EGF）作為釋放指標(biāo)進(jìn)行緩釋實(shí)驗(yàn)，證實(shí)5%HAMA + 20%PRP 釋放因子速率穩(wěn)定且合適，故以此濃度作為后續(xù)HP凝膠的濃度。通過用凝膠共培養(yǎng)細(xì)胞來評估HP凝膠對細(xì)胞增殖和遷移的影響，并最終證實(shí)HP凝膠促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和遷移（圖4.E-J）。

        

        圖4 HP凝膠的物理表征和生物學(xué)功能探索

4.仿生皮膚具有內(nèi)部協(xié)同效應(yīng)

仿生皮膚采用逐層鑄造構(gòu)建，其中GH凝膠層嵌入PCL膜片，通過物理嵌合的方式穩(wěn)定結(jié)合。接下來，GH和HP凝膠在405 nm光的激發(fā)下，在兩者的表面產(chǎn)生C═C雙鍵使之緊密結(jié)合。該仿生皮膚使細(xì)胞能夠同時(shí)接受PCL膜和PRP的刺激：PCL膜促進(jìn)細(xì)胞粘附和分化，而HP水凝膠促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移（圖5.A）。   

建立了四組進(jìn)行比較：僅具有 GH 水凝膠的空白組 （Blank）、包含 GH 水凝膠和 HP 水凝膠的對照組 （GHP）、由 PCL 膜和 GH 水凝膠組成的另一個(gè)對照組 （PCL） 以及具有完整皮膚結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)組 （MS）。仿生皮膚同樣具有良好的機(jī)械強(qiáng)度（圖5.B）。生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中仿生皮膚保留了向心性PCL膜片和HP凝膠的功能，且二者同時(shí)存在時(shí)，相關(guān)基因、蛋白呈現(xiàn)顯著性高表達(dá)（圖5.C-G）。結(jié)果證實(shí)了，PCL膜和HP凝膠在仿生皮膚內(nèi)具有協(xié)同作用，二者相互放大了彼此的生物學(xué)效應(yīng)，同時(shí)保留了各自的功能。這種協(xié)同作用確保了仿生皮膚作為一個(gè)整體發(fā)揮更全面的作用。

        

        圖5 仿生皮膚的物理表征和生物學(xué)功能探索

        

        圖6 仿生皮膚促進(jìn)傷口愈合的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評估

5.仿生皮膚促進(jìn)傷口修復(fù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

使用大鼠的全層皮膚缺陷模型在體內(nèi)評估仿生皮膚的功效（圖6.A, B）。通過將PCL膜的外框縫合到傷口邊緣周圍的正常皮膚上，將完整的仿生皮膚與身體結(jié)合在一起。缺損區(qū)與仿生皮膚的直徑差異使PCL膜在早期持續(xù)拉伸周圍皮膚，并通過縫合的預(yù)張力加速傷口閉合。同時(shí)，水凝膠不斷釋放生物刺激以促進(jìn)組織再生。因此，仿生皮膚通過結(jié)合機(jī)械和生物機(jī)制促進(jìn)傷口閉合和修復(fù)。   

利用H&E和Masson染色進(jìn)行組織學(xué)評估（圖 6.C-F）。MS組顯著促進(jìn)肉芽組織再生，加速了膠原蛋白沉積，促進(jìn)了傷口的修復(fù)。免疫熒光染色也證實(shí)了MS組具有最快的血管化和再上皮化進(jìn)程（圖7）。

        

        圖7 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的免疫熒光染色結(jié)果

綜上，這項(xiàng)研究設(shè)計(jì)開發(fā)了一種PCL/GelMA/HAMA/PRP仿生皮膚。通過模擬皮膚結(jié)構(gòu)和傷口修復(fù)的生理過程，仿生皮膚有效地促進(jìn)了傷口的早期閉合和快速愈合。在傷口修復(fù)的初始階段，仿生皮膚的膜框架通過預(yù)張力幫助傷口閉合，同時(shí)細(xì)胞在水凝膠內(nèi)增殖。隨著時(shí)間的推移，框架逐漸降解，細(xì)胞從水凝膠中釋放并沿著殘留的膜遷移。整個(gè)過程中，皮下層水凝膠持續(xù)釋放細(xì)胞因子，確保傷口得到全面的營養(yǎng)供給。這項(xiàng)研究不僅為皮膚損傷的治療提供了新的解決方案，也為組織再生工程開辟了新的可能性。

文章來源： EFL生物3D打印與生物制造